Pronipote per parte di madre del cardinale Carlo Confalonieri, Matteo Maria Zuppi, entrato nel seminario di Palestrina, consegue il baccalaureato in teologia presso la Pontificia Università Lateranense, quindi si laurea in Lettere e Filosofia all'Università di Roma, con una tesi in Storia del Cristianesimo.
Mons. Zuppi dopo la sua ordinazione episcopale, il 14 aprile 2012.
Ordinato presbitero nel 1981 nella cattedrale di Sant'Agapito martire a Palestrina, da tale anno al 2000 è viceparroco della basilica di Santa Maria in Trastevere a Roma, di cui poi è parroco fino al 2010.
Dal 2005 al 2010 è prefetto della III prefettura di Roma.
Rettore della chiesa di Santa Croce alla Lungara (dal 1983), membro del Consiglio presbiterale (dal 1995), nel 2010 è nominato parroco della chiesa dei Santi Simone e Giuda Taddeo a Torre Angela e, nel 2011, prefetto della XVII prefettura di Roma.
È anche cappellano di Sua Santità (dal 2006) e assistente ecclesiastico generale della Comunità di Sant'Egidio (dal 2000).
Nel 1990 svolge insieme ad Andrea Riccardi, Jaime Gonçalves e Mario Raffaelli il ruolo di mediatore nelle trattative tra il governo del Mozambico (all'epoca controllato dai socialisti del Fronte di Liberazione del Mozambico) e il partito di Resistência Nacional Moçambicana, impegnati sin dal 1975 in una guerra civile.
La mediazione condusse il 4 ottobre 1992, dopo 27 mesi di trattative, alla firma degli Accordi di pace di Roma che sancirono la fine delle ostilità.
Per questi eventi Zuppi e Riccardi vengono nominati cittadini onorari del Mozambico.
In seguito ha continuato ad operare con la cosiddetta "diplomazia parallela" della Comunità di Sant'Egidio.
Ministero episcopale
Vescovo ausiliare di Roma
Il 31 gennaio 2012 papa Benedetto XVI lo nomina vescovo ausiliare di Roma e vescovo titolare di Villanova; il 14 aprile successivo riceve l'ordinazione episcopale, nella basilica di San Giovanni in Laterano, dal cardinale Agostino Vallini, coconsacranti l'arcivescovo Giovanni Battista Pichierri e il vescovo Vincenzo Paglia (poi arcivescovo).
Arcivescovo metropolita di Bologna
Il 27 ottobre 2015 papa Francesco lo nomina arcivescovo metropolita di Bologna; succede al cardinale Carlo Caffarra, dimessosi per raggiunti limiti di età.
Il 12 dicembre prende possesso dell'arcidiocesi ed apre la porta santa della cattedrale di San Pietro.
Il 29 giugno 2016 riceve il pallio nella basilica di San Pietro in Vaticano da papa Francesco.
Il pallio, secondo le disposizioni del Santo Padre, gli viene imposto dal nunzio apostolico Adriano Bernardini il successivo 4 ottobre, nella basilica di San Petronio, in occasione della festa del santo patrono, alla presenza dei vescovi delle diocesi suffraganee di Imola Tommaso Ghirelli, Ferrara-Comacchio Luigi Negri e Faenza-Modigliana Mario Toso.
Indice il congresso eucaristico diocesano dal 13 novembre 2016 all'8 ottobre 2017.
Il 9 settembre 2017, nella cattedrale di san Pietro, celebra e presiede le solenni esequie del suo predecessore, il cardinale Carlo Caffarra.
Il 1º ottobre 2017 accoglie papa Francesco in visita pastorale a Bologna per la conclusione del congresso eucaristico diocesano.
Il 5 ottrobre 2019 è stato creato cardinale da Papa Francesco.
Il 24 maggio 2022 è stato eletto Presidente della Conferenza Episcopale Italiana.
Il 22 Ottobre 2022 è membro del Dicastero per le Chiese orientali
È uno dei vescovi che hanno celebrato la messa tridentina dopo il motu proprio Summorum Pontificum.
Nello stemma vi sono:
il libro del Vangelo, su cui è incisa la frase, tratta dal Vangelo secondo Giovanni, "Levate oculos vestros ad messem" (Alzate i vostri occhi alla messe);
un fiume, che ricorda Roma, sua città natale, fondata sul fiume Tevere;
la Croce con l'A e l'Ω, segno di Cristo, inizio e fine di tutte le cose, presente sull'arco trionfale della Basilica di Santa Maria in Trastevere a Roma, dove l'arcivescovo ha vissuto gran parte del suo ministero sacerdotale.
